Pe actualul loc al Bisericii Oţetari s-a aflat, iniţial, un zăvoi de oţetari, pe malul fostei gârle Bucureştioaia, afluent al Dâmboviţei, care îşi avea vadul pe actuala stradă Galaţi (date despre această apă găsim în Istoria fondării oraşului Bucureşti de Dimitrie Papazoglu). În anii 1680-1681 a fost construită, în zilele lui Şerban Vodă Cantacuzino, o bisericuţă din lemn, despre care găsim referiri în Istoria Bucureştilor de Ionescu-Gion şi în „Din vechiul Bucureşti între anii 1789-1791” de Gheorghe Florescu. Tot din lemn s-a refăcut, în anii 1691-1692, pe vremea Domnitorului Constantin Brâncoveanu (1688-1714), martir al creştinătăţii, o a doua biserică, iar după răzmeriţă a fost ridicată, în iulie 1757, sub Domnia lui Constantin -Vodă Mavrocordat, a treia Biserică, de data aceasta din zidărie, aşa precum aflăm dintr-un act al Mitropolitului Grigorie al Ungrovlahiei, din 1786. Din pisania veche, scrisă cu litere chirilice săpate în piatră, care se păstrează în pridvorul bisericii, aflăm că aceasta s-a zidit şi înfrumuseţat cu ajutorul lui Mărgărit Staroste, al lui Nicolae Cernavodeanu, al Jupânului Nicolae Cupeţul şi al altor creştini, „ca să le fie lor veşnica pomenire” La 25 august 1794, un ctitor pe nume Radu Nicule a dăruit Bisericii un clopot. În prima jumătate a secolului al XIX-lea, Biserica Oţetari, aşa cum avea să rămână întipărită în memoria bucureştenilor, a fost locul de îngropăciune al membrilor marii familii negustoreşti Hagi Tudorache, de la care se păstrează şi astăzi, în pridvorul Bisericii, două morminte cu pietre funerare, datate 1825 şi 1845. Cu prilejul restaurării din 1860-1866, pe timpul Mitropolitului Nifon Primat al României (1850-1875), cu ajutorul familiilor Hagii Tudorache, N. Zamfirescu şi Romanescu, unul dintre cei mai importanţi pictori români Gheorghe Tattarescu (1820-1894), a executat întreaga pictură murală în ulei a Bisericii Oţetari, precum şi iconostasul. Mitropolitul Nifon s-a născut la Bucureşti, în mahalaua Oţetarilor, pe uliţa Teilor, actuala stradă Vasile Lascăr, în anul 1789, ca fiu al blănarului Rusailă, originar din oraşul Castoria–Macedonia, care ajutat de Arhimandritul Iason a venit în Bucureşti, împreună cu soţia sa Aposta. Rusailă îl întâlnise la Salonic pe Arhimandritul Iason, în timpul unui pelerinaj la Sfântul Munte Athos. Arhimandritul Iason locuia împreună cu nepotul său, călugărul Sofronie, în curtea Bisericii Oţetari. Aici la Biserica Oţetari, va fi botezat viitorul Mitropolit şi va lua primele lecţii de învăţătură bisericească, de citire, scriere şi cântare psaltică, de la călugărul Sofronie.

Chipul Mitropolitului Nifon este pictat în pronaosul Bisericii Oţetari. Mitropolitul Nifon al Ungrovlahiei (1789-1875) a dăruit Bisericii Oţetari, după restaurarea încheiată la 1866, o falangă dintr-un deget al Sfântului Mare Mucenic Haralambie (89 d.Hr.–10 februarie 202 d.Hr.), cel mai longeviv sfânt creştin. Părinţii Sfântului Mucenic Haralambie, au fost botezaţi de Sf. Apostol Ioan, iar despre bunicii săi se spune că ar fi fost botezaţi chiar de către Sf. Ioan Botezătorul.